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Archivos de medicina veterinaria
Print version ISSN 0301-732X
Arch. med. vet. vol.41 no.3 Valdivia 2009
http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X2009000300008
Arch Med Vet 41, 237-244 (2009)
ARTÍCULO ORIGINAL
Francisella philomiragia, bacteria asociada con altas mortalidades en salmones del Atlántico (Salmo salar) cultivados en balsas-jaulas en el lago Llanquihue
Francisella philomiragia, a bacteria associated with high mortalities in Atlantic salmon (Salmo salar) cage-farmed in Llanquihue lake
H Bohle *, E Tapia, A Martínez, M Rozas, A Figueroa, P Bustos
Laboratorio de Diagnóstico y Biotecnología, ADL Diagnostic Chile Ltda., Puerto Montt, Chile.
* Casilla 160, Puerto Montt, Chile; hbohle@adldiagnostic.cl.
SUMMARY
Francisella philomiragia was isolated from Atlantic salmon cage-farmed in the Llanquihue lake with outbreaks of a granulomatous disease, with high rates of morbidity and an accumulated mortalities between 5% to 20%. The isolates had 100% similarity with F. philomiragia ssp noatunensis or F. piscicida isolated in Atlantic cod, 99% similarity with Francisella sp. detected in tilapia from Asia and Central America and 99% of similarity with the reference strain F. philomiragia through 16s rDNA phylogenetic analysis.
Key words: Francisella philomiragia, Atlantic salmon, phylogenetic analysis.
RESUMEN
Francisella philomiragia fue aislada de salmón del Atlántico cultivado en balsas-jaulas en el lago Llanquihue con brotes de una enfermedad granulomatosa con altas tasas de morbilidad y mortalidad acumuladas entre 5% a 20%. Los aislados bacterianos tienen 100% similitud con F. philomiragia ssp noatunensis o F. piscicida aislado de bacalao en Noruega, 99% de similitud con Francisella sp. detectado en tilapia en Asia y Centroamérica y 99% de similitud con la especie tipo F. philomiragia por análisis filogenético del gen 16s rDNA.
Palabras clave: Francisella philomiragia, salmón del Atlántico, análisis filogenético.
INTRODUCCIÓN
A fines de la década de 1980, se detectó en Chile una nueva patología infecciosa cuyo agente causal presentaba morfología rickettsial (Bravo y Campos 1989) y fue denominado "unidentified agent". Este agente fue aislado por primera vez en una línea celular de embrión de salmón Chinook CHSE-214 (Fryer y col 1990) y posteriormente identificado como Piscirickettsia salmonis (Fryer y col 1992). La piscirickettsiosis ha sido una de las principales causas de mortalidad en salmónidos cultivados en las costas marinas del sur de Chile y ha significado grandes pérdidas económicas para la salmonicultura chilena. Sin embargo, a mediados de la década de los 1990 se logró aislar un segundo agente con morfología rickettsial en salmón del Atlántico cultivado en el lago Llanquihue (Cvitanich y col 1995), denominado "unidentified agent 2" (U2 o UA-2) para diferenciarlo de P. salmonis (Unidentified agent). Desde junio del 2006 planteles de salmón del Atlántico cultivado en balsas-jaulas en el lago Llanquihue presentaron altas tasas de morbilidad y mortalidad, con varios y simultáneos brotes de una enfermedad crónica de tipo granulomatosa principalmente evidenciada a nivel de bazo y que en todos los casos se detectó y se aisló un agente bacteriano con morfología rickettsial sugerente de U2 (Birkbeck y col 2007).
El análisis filogenético de las secuencias del gen 16s rDNA de los aislados reveló pertenecer a la familia Francisellaceae, la que fue descrita en el año 2005 por Sjøstedt y agrupa a bacterias dentro de la subclase gamma proteobacteria y tiene un solo género, Francisella. Este género tiene dos especies tipo, F. tularensis patógeno humano (Nano y col 1992) y F. philomiragia aislado desde fuentes de agua, ratas de río y de algunas infecciones accidentales en humanos (Hollis y col 1989). Adicionalmente, existe una gran cantidad y variedad de otras Francisella sp. de afiliación incierta y que han sido aisladas de diversas fuentes tales como garrapatas (Scoles 2004), del ambiente (Barns y col 2005) y de una amplia variedad de peces (Chen y col 1994, Mauel y col 2003, Nylund y col 2006). El análisis filogenético de los genes 16s rDNA, espaciador intergénico (ITS), 23s rDNA, rpoB, fopA, groEL, lpnB y sdhA, reveló que los aislados pertenecen al grupo F. philomiragia y un 100% de similitud con F. philomiragia ssp noatunensis (Mikalsen y col 2007), formando parte del mismo grupo en conjunto con otras Francisellas aisladas de bacalao en Noruega, tilapia en Asia y América Central (Nylund y col 2007, Mikalsen y col 2007, Mauel y col 2007).
El presente estudio tiene como objetivo mostrar antecedentes generales de la patología, condiciones de aislamiento, fisiológicos, susceptibilidad y filogenéticos de los aislados bacterianos de Francisella philomiragia aislados de salmón del Atlántico.
MATERIAL Y MÉTODOS
PECES
Salmones del Atlántico con brotes de la enfermedad fueron capturados y trasladados al laboratorio de diagnóstico y biotecnología de ADL Diagnostic Chile Ltda. para su análisis clínico. Los peces presentaron un peso promedio de 60 g (30 a 80 g), con una mortalidad mensual acumulada entre 5 a 20% en la mayoría de los centros de cultivo (9 de 15 centros).
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO, SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y CULTIVO CELULAR
Tejidos de riñón, bazo, hígado, corazón, aletas y branquias de los peces afectados fueron cultivados bajo condiciones de completa asepsia en los medios bacteriológicos agar tripticasa de soya1, agar columbia suplementado con 5% sangre cordero2, agar Mueller-Hinton1, Agar nutriente1 0% y 6% NaCl, agar BHI1 y agar Eugon1 suplementado con 0,1% L-cisteína3, 1% glucosa4, 6% (v/v) yeastolate5 y 10% (v/v) suero fetal bovino6 e incubados por 8 semanas a 18 °C con monitoreo diario para la observación de crecimiento de colonias bacterianas. Desde las colonias bacterianas se realizó tinción Gram4 para evaluar la morfología y características tintoriales, además de las pruebas bioquímicas de oxidasa4 y catalasa. Adicionalmente, se determinó la sobrevivencia de los aislados en agar Eugon enriquecido y suplementado con diferentes concentraciones finales de NaCl4 (0,4%, 1%, 2%, 3% y 6%) a 18 °C por 8 semanas de incubación. Paralelamente, se evaluó el desarrollo de colonias de los aislados en agar Eugon enriquecido a diferentes temperaturas (5, 10, 15, 18, 20, 22, 25, 30 y 37 °C ) durante 8 semanas de incubación. Se determinó la concentración inhibitoria mínima de los aislados para florfenicol7, amoxicilina7, flumequina7, oxitetraciclina7 y ácido oxolínico7 según método de medición de susceptibilidad en dilución en caldo para bacterias aisladas de animales acuáticos (M49-A, CLSI 2006) usando como control E. coli ATCC 25922.
Riñones asépticamente tomados con tórula2 fueron inoculados en placas de 24 pocillos8 con las líneas celulares CHSE-214 (Chinook salmo embryo) cultivado en MEM-105, 2 mM L-glutamina5 y sin antibióticos. Otras líneas celulares también fueron inoculadas como SHK-1 (Salmo salar head kidney), BF-2 (Bluegill fry caudal trunk) en medio Leibovitz L-155 y en líneas celulares continuas desarrolladas en ADL Diagnostic Chile Ltda., correspondientes a RTR-2 (Rainbow trout renoma, 2005) y OKE-1 (Coho salmo embryo, 2003) cultivadas en Leibovitz L-15. Todas las líneas celulares fueron incubadas por 8 semanas a 15 °C con monitoreo diario para la aparición de efecto citopático (ECP).
ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO Y MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Trozos de riñón, bazo e hígado de los peces con lesiones granulomatosas fueron fijados en formaldehído al 10% en PBS (pH 7,2) para su análisis histopatológico. Las muestras procesadas fueron teñidas con hematoxilina-eosina de Harris y tinción Gram previo a su análisis.
Para el análisis por microscopia electrónica fue cosechado 1 ml de suspensión celular de las líneas celulares que presentaron 50% CPE y se centrifugó a 3.000 rpm por 10 minutos, posteriormente el sobrenadante fue eliminado y el botón celular fue resuspendido en glutaraldehído4 al 3% en PBS (pH 7,2). Las muestras fueron enviadas a la Universidad Prince Edward Island (UPEI) en la ciudad Charlottetown en Canadá para su procesamiento y análisis.
AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIAMIENTO DE LOS GENES 16s rDNA, ITS, 23s rDNA, rpoB, fopA, groEL, lpnB Y sdhA
El ADN genómico bacteriano fue extraído utilizando las columnas de extracción EZNA® tissue DNA kit9, siguiendo las instrucciones del fabricante. La amplificación por PCR de los genes fue llevada a cabo utilizando los partidores descritos en el cuadro 1. Las amplificaciones de PCR fueron ejecutadas en un termociclador T3 (Biometra, Inglaterra) en un volumen final de 50 µl, con una mezcla de 46 µl que contiene 1 U Taq polimerasa10, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 0,2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,2 µM de cada partidor y 4 µl de templado. El perfil térmico utilizado fue de: paso de denaturación inicial a 95 °C por 3 min; 30 ciclos a 95 °C por 40 seg, 50 °C por 40 seg, 72 °C por 1,5 min, seguido por una extensión final a 72 °C por 5 min. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa 2% y las bandas correspondientes purificadas con el kit comercial EZNA® Gel extraction kit9 siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ADN purificado fue secuenciado con el Kit BigDye® Terminator v3.111 en un analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystem, EUA) utilizando partidores descritos en el cuadro 1. Las secuencias obtenidas fueron analizadas y editadas con el software Sequencing Analysis v5.2 (Applied Biosystem, EUA) y luego publicadas en la base de datos pública GenBank (NCBI, EUA) con los siguientes números de acceso: EU931318 rpoB (261 pb), EU931319 groEL (702 pb), EU931320 sdhA (218 pb), EU931321 fopA (960 pb), EU931322 lpnB (252 pb) y EU931323 para 16s ITS 23s rDNA (1748 pb).
ANÁLISIS FILOGENÉTICO
El análisis filogenético de los genes fue realizado por alineamientos múltiples de secuencias de especies bacterianas relacionadas para el gen 16s rDNA (figura 1), con la información de los genomas de Francisella disponibles en GenBank para los genes 16s+ITS+23s rDNA (figura 2a) y el análisis multilocus con los genes constitutivos (Housekeeping) rpoB, groEL, sdhA, fopA y lpnB (figura 2b) con el software ContigExpress y AlignX (Vector NTi v10.0, Invitrogen, EUA), editados y exportados a formato NEXUS con BioEdit 7.0.9.0 (Hall 1999). Los tres árboles filogenéticos obtenidos fueron construidos con el criterio de la regla de la mayoría (50%) a partir de 1000 réplicas de bootstrap con el método de máxima similitud ejecutado en PAUP v4.0b10 (Swofford 2002) usando el proceso heurístico de búsqueda con la opción de bisección y recombinación (TBR) con el modelo HKY+G para el análisis del gen 16s rDNA, HKY para el análisis de los genes 16s+ITS+23s rDNA y TrN+G para el análisis multilocus de los genes constitutivos, todos los modelos seleccionados por el software Modeltest (Posada y Crandall 1998).
RESULTADOS
OBSERVACIONES DE CAMPO Y NECROPSIA
Los peces afectados se caracterizaron por presentar anorexia, natación errática en la superficie y letargia. A la necropsia, mostraron aumento de tamaño del hígado, riñón y bazo, con múltiples focos blanquecinos en el hígado y bazo, con grasa perivisceral y vejiga natatoria congestiva y en los casos más severos con equimosis.
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO, SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y CULTIVO CELULAR
Los cultivos bacterianos en agar tripticasa de soya, agar columbia sangre, agar Mueller-Hinton, agar nutriente con y sin sal y agar BHI fueron negativos a las 8 semanas de incubación. Sin embargo, se observó desarrollo de colonias redondas de 1 a 2 mm de diámetro, de consistencia butirosa, convexas, brillantes, de color gris-verdoso sin pigmento difusible en agar Eugon, con crecimiento visible a los 12 días de incubación a 18 °C. La tinción Gram de las colonias evidenció estructuras cocoides y cocobacilares Gram negativas dispuestas individuales, en pares y agrupaciones, con test de oxidasa negativo y reacción de catalasa débil. En el desafío a diferentes salinidades, los aislados se desarrollaron solamente entre 0,4% a 1% NaCl, escasamente a 2% y no hubo desarrollo a 3% y 6%. Adicionalmente, en el desafío a diferentes temperaturas, los aislados no se desarrollaron a 5 °C , 30 °C y 37 °C a las 8 semanas de incubación, el desarrollo fue lento a los 10 °C , 15 °C y 25 °C y abundante a los 18 °C , 20 °C y 22 °C . Se evidenció desarrollo inicial a los 6 días a 22 °C y 12 días a 18 °C de incubación. Las concentraciones inhibitorias mínimas obtenidas fueron para florfenicol 1,0 µg/ ml, flumequina 0,25 µg/ml, ácido oxolínico 0,25 µg/ml, oxitetraciclina 0,5 µg/ml y amoxicilina > 64,0 µg/ml.
En los cultivos celulares se observó efecto citopático en OKE-1 a las dos semanas de incubación, a diferencia de BF-2 donde se observó desprendimiento celular de la monocapa celular a los 12 días de incubación; SHK-1 presentó CPE y desprendimiento celular a los 20 días de incubación. El resto de las líneas celulares CHSE-214 y RTR-2 no presentaron efecto citopático o desprendimiento celular a las ocho semanas de incubación; sin embargo, a la tinción Gram y microscopía electrónica se observó la presencia del agente y cambio en la morfología celular ultraestructural en estas últimas líneas celulares.
ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO Y MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
El análisis histopatológico reveló una patología sistémica con degeneración celular y necrosis ampliamente diseminada a través del hígado, bazo y riñón. Los bazos presentaron degeneración del tejido conectivo y con esplenocitos con núcleos picnóticos y cariorréxicos. Los leucocitos y en particular los macrófagos fueron observados como células hipertróficas con vacuolas intracitoplasmáticas, algunas de las cuales contenían agrupaciones de bacterias cocoides basofílicas. En el tejido hematopoyético del bazo se observó una necrosis extensiva con degeneración y lisis de la membrana nuclear y citoplasmática. Los riñones se observaron con una glomeronefritis crónica y difusa con acumulación de centros de melanomacrófagos distribuidos ampliamente en el tejido necrótico. Hepatitis y necrosis ampliamente distribuida, con degeneración hidrópica de los hepatocitos y megalocitosis, con ruptura aislada de los ductos biliares presentando exudado biliar en el parénquima del hígado.
La tinción Gram permitió observar bacterias de formas cocoides y cocobacilares teñidas Gram negativas formando agrupaciones intracitoplasmáticas o libres en la matriz extracelular o detritus celular en diferentes tejidos como riñón, bazo, hígado, corazón, aletas y branquias.
El análisis por microscopia electrónica mostró agrupaciones de bacterias de forma cocoide y elongadas (300 a 1.000 nm) dentro de vacuolas (endosomas o fagosomas) contenidas en el citoplasma de las células de las líneas celulares de tipo macrofágicas OKE-1 y SHK-1 (figura 3).
ANÁLISIS FILOGENÉTICO
La secuencia nucleotídica del gen 16s rDNA obtenida (número acceso: EU931323) del aislada fue analizada con el programa BLASTN y mostró 99% de similitud con F. piscicida TU101106 (EF685355), F. philomiragia ssp noatunensis 2006/09/130 (EF490217), Francisella sp. AF-01-2 (AY928388) y F. philomiragia ssp philomiragia ATCC 25015 (AY928394) y un 97% de similitud con F. tularensis ssp tularensis WY96-3418 (CP000608), F. tularensis ssp novicida U112 (CP000439), F. tularensis ssp mediasiatica FSC 147 (CP000915) y F. tularensis ssp holarctica FTNF002-00 (CP000803). El análisis filogenético de los genes 16s+ITS+23s rDNA del aislado mostró 100% de similitud con F. piscicida y F. philomiragia ssp noatunensis, 99% similitud con F. philomiragia ssp philomiragia y 97% de similitud con las subespecies de F. tularensis. Finalmente, el análisis multilocus de los genes constitutivos mostró 100% de similitud con F. piscicida y F. philomiragia ssp noatunensis, un 96% de similitud con F. philomiragia ssp philomiragia y un 84% de similitud todas las subespecies de F. tularensis.
DISCUSIÓN
Salmón del Atlántico cultivado en el lago Llanquihue presentó, sin precedentes en la acuicultura nacional, altas tasas de morbilidad y mortalidad por la bacteria entre junio (Birkbeck y col 2007) a diciembre del año 2006, con un comportamiento, signos y lesiones muy similares a las descritas por organismos similares a U2 (Birkbeck y col 2007), otras rickettsias (RLO) y a Francisella sp. detectadas en otras partes del mundo, como en tilapia en Costa Rica (Mauel y col 2007) y Hawaii (Mauel y col 2003), bacalao en Noruega (Nylund y col 2006, Ottem y col 2007a), corvina blanca en California (Chen y col 2000), mero en Taiwán (Chen y col 1994) y U2 en puyes en Chile (Enríquez y col 1998).
Una inusual alza en la densidad de puyes (Galaxias maculatus) dentro y fuera de las balsas-jaulas con altos niveles de F. philomiragia en riñón, hígado y bazo (datos no mostrados), más la evidencia de transmisión horizontal entre el puye y salmón del Atlántico (Brossard 1999) en el caso de tratarse de U2, podría explicar la rápida diseminación en poco tiempo y la persistencia de los cuadros clínicos en casi todos los centros de cultivo de salmón del Atlántico presentes en el lago Llanquihue. Estos sucesos también han sido descritos en otros RLOs y Francisella sp., donde la transmisión horizontal es por contacto directo entre peces de la misma especie o diferentes especies o por medio de la misma agua (Chern y Chao 1994, Chen y col 1994, Mauel y col 2003) y en una amplia gama de peces de agua dulce y mar (Mauel y col 2007) y de temperaturas que van entre los 6 °C hasta los 26 °C (Nylund y col 2006, Mauel y col 2007).
El análisis histopatológico reveló un patrón muy similar a los ya descritos previamente en Chile en salmón del Atlántico afectados por U2 (Cvitanich y col 1995), con lesiones de tipo granulomatosas de distribución difusa y penetrantes en los diferentes tejidos del huésped con un tropismo por los fagocitos o células que cumplen función fagocítica, muy similar a lo observado por análisis histopatológicos descritos en otras especies como bacalao (Nylund y col 2006) y tilapia (Mauel y col 2003) afectados por Francisella. El análisis ultraestructural de la bacteria mostró un tamaño de 1 µm en su forma elongada, muy similar a lo observado en F. philomiragia con un tamaño menor a 1,5 µm pero diferente a F. tularensis (Nylund y col 2006, Ottem y col 2007a) que generalmente es menor a 0,5 µm.
Desde el punto de vista zoonótico, no se han registrado casos de infecciones accidentales en humanos de F. philomiragia aisladas de salmón del Atlántico o por las Francisella sp. aisladas desde peces en otras partes del mundo. Esto podría estar relacionado con la incapacidad que tienen estas fenovariantes de F. philomiragia de crecer a temperaturas más altas como 37 °C, a diferencia de F. philomiragia ssp philomiragia y todas las subespecies de F. tularensis que crecen muy bien a 37 °C y que provocan enfermedades infecciosas en humanos y otros mamíferos terrestres. Las características fastidiosas en crecimiento de aislados bacterianos de salmón del Atlántico en líneas celulares y medios basados en agar o caldo son muy similares a las encontradas en F. piscicida (Nylund y col 2006) o F. philomiragia ssp noatunensis (Mikalsen y col 2007); sin embargo, son diferentes a F. philomiragia ssp philomiragia y las subespecies de F. tularensis que crecen en condiciones nutricionales mucho menos exigentes y en menor tiempo o diferentes incluso a las Francisella sp. detectadas en tilapia, las cuales no han podido ser aisladas tanto en líneas celulares como en medios basados en agar (Mauel y col 2007).
Desde el punto de vista filogenético, el análisis del gen 16s rDNA (figura 1 y 2a) y de los genes constitutivos (figura 2b) mostraron que los aislados bacterianos de salmón del Atlántico pertenecen al grupo de las F. philomiragia, al igual que las Francisella sp. detectadas desde bacalao en Noruega o en tilapia en Costa Rica y Asia. El grupo F. philomiragia presenta dos subespecies definidas por el comité internacional de taxonomía y que corresponde a la especie tipo F. philomiragia quedando como F. philomiragia ssp philomiragia y F. noatunensis12 (F. piscicida) quedando como F. philomiragia ssp noatunensis.
El análisis del alineamiento múltiple de secuencias reveló que en el ITS ubicado entre el gen 16s y 23s rDNA existe una zona comprendida entre la posición 1673 a la 1684 que diferencia claramente (cuadro 2) entre las especies tipo F. philomiragia de la F. tularensis; sin embargo, existen otras regiones como la comprendida entre la posición 166 a la 191 (cuadro 2) que diferencian F. philomiragia ssp noatunensis de F. philomiragia ssp philomiragia de ratas (Ottem y col 2007b) y de las subespecies de F. tularensis. Más aún, otras posiciones como las 215, 1557, 1726, 1823 (cuadro 2) diferencian F. philomiragia de salmón del Atlántico con la firma o combinación AGTT de todo el resto de las especies de Francisella y que poseen "GACA" (cuadro 2) en esas mismas posiciones. Sin embargo, e independiente de las variaciones nucleotídicas encontradas dentro del grupo F. philomiragia (cuadro 2), el análisis filogenético (figura 1, 2a y 2b) reveló que las Francisellas aisladas en bacalao en Noruega, salmón del Atlántico en Chile y tilapia en Centroamérica y Asia, pertenecerían al mismo grupo de F. philomiragia ssp noatunensis (Mikalsen y col 2007), aunque fenéticamente las Francisellas aisladas en estos diferentes huéspedes, incluyendo salmón del Atlántico, presentan características propias diferentes a las encontradas entre los miembros de la misma subespecie (cuadro 3), por lo cual es necesario hacer más investigaciones filogenéticas con nuevos marcadores o filogenómica.
NOTAS
1 Difco, EUA
2 Linsan SA, Chile
3 Calbiochem, EUA
4 Merck, Alemania
5 Gibco, EUA
6 Hyclone, EUA
7 Aquafarma, Chile
8 Nunclon, Dinamarca
9 Omega Bio-Tek, EUA
10 Invitrogen, EUA
11 Applied Biosystems, EUA
12 Mikalsen J, 2008. Comunicación personal.
REFERENCIAS
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Aceptado: 03.06.2009
